Электрофорез

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА




БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА БИОИНЖЕНЕРИИ








ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ




Методическая разработка


















Москва 2007.
Аннотация
Задачи спецпрактикума включают в себя изучение теоретических основ электрофореза (по теоретической частипрактикума сдается коллоквиум), а также практические методики использования электрофореза в полиакриламидном геле для анализа различных белков и пептидов (по практической части практикума сдается зачет).
Спецкурс рассчитан на студентов 4-го курса, уже изучивших основы биохимии. Необходимое время для проведения практикума – 12 академических часов. Для проведения практикума необходима лаборатория,оснащенная электрофоретическим оборудованием и системой гель-документирования, а также персональными компьютерами с соответствующим программным обеспечением для обработки и анализа полученных результатов.
Программа практикума
1. Теоретические основы электрофореза. Обзор различных видов электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле для разделения белков и пептидов. Коллоквиум потеоретической части.
2. Приготовление необходимых растворов и полимеризация полиакриламидных гелей.
3. Сборка аппарата для проведения электрофореза белков в ПААГ. Подготовка и нанесение образцов. Проведение электрофореза. Фиксация и окраска геля.
4. Документирование геля и анализ результатов.

Задачи практикума

Теоретическая часть

I. Основы электрофореза

Электрофорез – этоперемещение заряженных частиц в растворе (в зависимости от знака их суммарного электрического заряда) к аноду или катоду под действием электрического поля. Поскольку скорость движения молекул в электрическом поле зависит от их заряда, формы и размера, то электрофорез может быть использован для их разделения.
Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическимзарядом, величина и знак которого зависят в основном от рН среды. Если через этот раствор начать пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров макромолекулы приобретаютразные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул мигрирующих с одной и той же скоростью. Однако в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны, поэтому обычно электрофорез проводят в гелеобразной среде. Наличие сетки геля приводит к тому, что теперьфракционируемые макромолекулы сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние наэлектрофоретическую подвижность различных молекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров.
Электрофорез позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.
Биологическиемакромолекулы – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и др. – находятся в водном растворе в виде частиц, несущих определённый электрический заряд. Заряд макромолекулы определяется входящими в ее состав группами, способными к электролитической диссоциации. Степень диссоциации групп зависит от многих факторов, в частности, от рН среды. Общий заряд биологической...